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几种特殊光学显微镜的工作原理及其使用
  • 发布日期:2011-01-21      浏览次数:694
    • 一、暗视野显微镜
              (一) 原理和结构特点
              在日常生活中,室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的,但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来,灰尘便粒粒可见了,这是光学上的丁达尔现象。暗视野显微镜就是利用此原理设计的。它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器,常用的是抛物面聚光器,使光源的中央光束被阻挡.不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径,倾斜地照射在观察的标本上,标本遇光发生反射或散射,散射的光线投入物镜内,因而整个视野是黑暗的。在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像.并非物体的本身,所以只能看到物体的存在和运动,不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时,并大于1/2波长,则各级衍射光线同时进入物镜,在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构,但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动,这是普通显微镜(zui大的分辨力为0.2um)所不具有的特性,可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。
              (二) 制作中央遮光板
              普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的,支架的口径适于安装暗视野聚光器,即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光器时,可用厚黑纸片制作一个中央遮光板,放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上,也能得到暗视野效果。
              1.将显微镜聚光器调到zui高位置,用低倍镜对好焦距。
              2.取下目镜,从镜筒中观察并调节光阑的大小,使其与镜筒中所见物镜的视野相等。
              3.用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径与滤光片框架相同,中央部分的大小与调节好的光阑孔径一样(可用半透明的小纸片,放在通光孔处聚光镜镜面上,纸上显示的光斑即为光阑的孔径,再用圆规量取大小)。
              4.将中央挡光板放在滤光片框架上,开大光阑进行样品观察。
              如需使用高倍镜作暗视野观察,应按高倍镜对焦后的视野大小重新制作中央挡光板。
              保存好各自制作的中央遮光板,以便在后面的实验中使用。
             (三)使用方法
               1.把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。
               2.选用强的光源,但又要防止直射光线进入物镜,所以一般用显微镜灯照明。 
               3.在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油,目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射,达不到被检物体,而得不到暗视野照明。
               4.升降集光器,将集光镜的焦点对准被检物体,即以圆锥光束的顶点照射被检物。如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置,则应首先进行中心调节,使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。
               5.选用与聚光器相应的物镜,调节焦距<操作方法与普通显微镜相同=,找到所需观察的物像。
              (四)观察 观察示教台上暗视野显微镜下的活细胞。在黑暗的背景里,可见细胞、细胞核和细胞器的衍射光图像。
              二、相差显微镜
              (一) 原理和结构特点
              光波有振幅(亮度)、波长(颜色)及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。当光通过物体时,如波长和振幅发生变化,人们的眼睛才能观察到,这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本,因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同,光波通过时,波长和振幅并不发生变化,仅相位有变化(相应发生的差异即相差),而这种微小的变化,人眼是无法加以鉴别的,故在普通显微镜下难以观察到。相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位,并且利用光的衍射和干涉现象,把相差变成振幅差(明暗差),同时它还吸收部分直射光线,以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。 相差显微镜(图2—3)与普通显微镜的主要不同之处是:用环状光阑代替可变光阑,用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜,并带有一个合轴用的望远镜。环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑,它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。相板安装在物镜的后焦面处,相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外,还有吸收光使亮度发生变化的作用。调轴望远镜是用来进行合铀调节的。相差显微镜在使用时,聚光镜下面环f状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上,必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐,才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱,应被吸收的光不能吸收,该推迟相位的光波不能推迟,就失去了相差显微镜的作用。
              (二)使用方法 相差装置为多功能系列显微镜中的附属装置.与普通显微镜配合使用。
              1.相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器,将环状光阑装在聚光器支架上,把绿色滤光片放在上面,它可吸收红色和蓝色光,使波长范围小的单色光线进行照明,并有吸热作用,能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜,换上相差物镜。
              2.调焦 打开光源,旋转集光器转盘,将“o”对准标示孔,使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜,按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状光阑,使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应,如相差物镜为40 x时应用x40标示孔的光阑。
              3.合铀调整 拔出目镜,插入合铀望远镜,一边从望远镜内内观察,并用左手固定其外筒;一边用右手转动望远镜内筒使其下降,当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环,此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致,然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮,使两环完全重合<图2—        4.  如亮环比黑环小而位于内侧时,应降低集光器使亮环放大;反之,则应升高聚光器,使亮环缩小。如若升到zui高限度仍不能完全重合,则可能是载玻片过厚之故,应更换。合抽调整完毕,抽出望远镜,换回目镜,按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时,每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合抽调整。使用油镜时,集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上香伯泊。
             (三)观察 在相差显微镜下观察活细胞,可清楚地分辨细胞的形态,细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状结构。
              三、荧光显微镜
             (一)原理和结构特点 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源,经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后,再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下,即使荧光很微弱也易辨认,敏感性高,主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W),它可发出各种波长的光,但每种荧光物质都有一个产生zui强荧光的激发光波长,所以需加用激发滤片(一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片),仅使一定波长的激发光透过照射到标本上,而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后,在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性,一般都比激发光弱,为能观察到专一的荧光,在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二:一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛?二是选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。
              荧光显微镜就其光路来分有两种:
              1.透射式荧光显微镜 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的(图2—5)。常用暗视野集光器,也可用普通集光器,调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上.这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强,而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱.所以对观察较大的标本材料较好。
              2.落射式荧光显微镜 这是近代发展起来的新式荧光显微镜,与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面,即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜(图2—6)。光路中需加上一个双色束分离器,它与光铀呈45。角,激发光被反射到物镜中,并聚集在样品上,样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜,反回到双色束分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组合插块,可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强。

              (二)使用方法.
              1.打开灯源,超高压汞灯要预热几分钟才能达到zui亮点。
              2.透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片,在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的插块。
              3.用低倍镜观察,根据不同型号荧光显微镜的调节装置,调整光源中心,使其位于整个照明光斑的中央。
              4.放置标本片,调焦后即可观察。 使用中应注意:末装滤光片不要用眼直接观察,以免引起眼的损伤;用油镜观察标本时,必须用无荧光的特殊油镜;高压汞灯关闭后不能立即重新打开,需经5分钟后才能再启动,否则会不稳定,影响汞灯寿命。
               (三)观察 在示教台上的荧光显微镜下<用蓝紫光滤光片=,可见经o.01%的丫啶橙荧光染料染色的细胞,细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。

       
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